W wieku lat 4 był świadkiem wielu śmierci spowodowanych wojną, które odbiły się na jego psychice i zachowaniu. Wkótce potem został okrzyknięty geniuszem. W wieku lat 7 w rok ukończył Akademię Ninja, rok później aktywował Sharingan. Chūninem został w wieku 10 lat, a jako trzynastolatek był już kapitanem ANBU. Przewyższał siłą i umiejętnościami wszystkich pozostałych członków klanu Uchiha. Aby posiąść wyższy poziom Sharingana (Mangekyō Sharingan) zabił najlepszego przyjaciela - Shisui Uchiha i upozorował jego samobójstwo zostawiając przy nim kartkę, na której zapisał swoje własne odczucia. Oskarżony o morderstwo pobił oddział policji mówiąc, że ludzie nienawidzą i lękają się tych, których nie rozumieją oraz, że przywiązanie jest ograniczaniem swoich potencjałów. By zapobiec nadchodzącej wewnątrz klanowej wojnie Itachi, wraz z Madarą Uchiha, z rozkazu Trzeciego Hokage dokonuje mordu na wszystkich jego członkach, pozostawiając przy życiu jedynie młodszego brata - Sasuke, dzięki któremu chciał w przyszłości pozyskać najsilniejszą odmianę Sharingana. Itachi jest głównym obiektem obsesyjnej zemsty, jaka ogarnęła umysł Sasuke od czasu upadku klanu. Pragnienie zabicia brata, świadomie przez niego podsycane, jest podstawowym silnikiem działań Sasuke. Itachi jest posiadaczem wyższego poziomu Sharingana - Mangekyō Sharingan. Jest to genjutsu, z którego nie można się uwolnić. Aby aktywować Mangekyō Sharingan należy zabić najbliższego przyjaciela lub, jak pokazał przypadek Sasuke, inną bliską osobę.

Po opuszczeniu wioski Itachi dołącza do tajemniczej organizacji zwanej Akatsuki. Po latach nieobecności, wraz ze swoim partnerem Kisame Hoshigaki, wraca do Konohy z misją porwania Naruto dla zapieczętowanego w nim pożądanego przez organizację Kyūbiego.

Itachi stosunkowo mało pokazuje swoje uczucia. Charakteryzuje się zimnym, ale skutecznym kalkulowaniem sytuacji w walce. Jest cichy, tajemniczy i chłodny. Posiada mroczną, nie ukazującą uczuć osobowość. Wszystkie swoje uczucia i emocje tłumi w głębi serca, nie pozwalając by były widoczne na jego twarzy czy w zachowaniu. Wyjątkami są momenty, kiedy Itachi spogląda zamyślony w niebo.

Podczas walki Itachi przeważnie stosuje taktykę defensywną i rzadko atakuje. Kiedy staje do walki z przeciwnikiem korzystającym z technik genjutsu używa Sharingana do wykonania Demonicznej Iluzji: Lustra Zamiany Nieba i Ziemi (Magen: Kyōten Chiten), aby skierować genjutsu przeciwko jego użytkownikowi.

Mangekyō Sharingan umożliwia Itachiemu wykonanie najpotężniejszych technik klanu Uchiha. Tsukiyomi, którego używa lewym okiem, więzi przeciwnika w iluzorycznym świecie, gdzie jest poddawany torturom psychicznym przez kilka dni, która naprawdę trwają to tyle, co mrugnięcie oka. Amaterasu, używane przez prawe oko, tworzy czarny ogień, który jest gorący jak słońce i potrafi przepalić każdą przeszkodę. Susanoo jest zaś wielkim eterycznym wojownikiem w kształcie szkieletu, który chroni użytkownika tej techniki przed każdym atakiem.

Ze standardowych technik ninjutsu Itachi potrafi tworzyć własne cieniste klony, które przeprowadzają ataki, podczas gdy on sam unika walki. Może też wydać polecenie Bunshin Daibakuha, przez co wybuchające klony są w stanie zabić osoby znajdujące się w zasięgu eksplozji. Jako członek klanu Uchiha jest w stanie wykonać Katon: Gōkakyū no Jutsu do złapania przeciwników w pułapkę z ognia oraz Katon: Hōsenka no Jutsu, przy pomocy której wydmuchuje wiele małych kul ognistych. Za pomocą techniki Suiton: Suigadan, potrafi otoczyć cel kręgiem miażdżącej wody. Techniki i ruchy Itachiego są bardzo szybkie, podobnie jak Kakashiego w pierwszej części.

W Naruto Shippuuden Itachi kontroluje własnego klona, który posiada 30% siły i chakry oryginału (tę kopię Itachiego stworzył Pein). W czasie, gdy klon walczy, członkowie Akatsuki zyskują na czasie by móc ukończyć wyssanie Shukaku z ciała Gaary i zapieczętować go. Po pokonaniu Orochimaru Itachi zostaje ostrzeżony przez Peina o zamiarach Sasuke. Kiedy do Konohy dociera informacja o śmierci Orochimaru, Naruto postanawia wyruszyć z wioski, by odnaleźć Sasuke i Itachiego. Chwilę przed walką z bratem, Itachi spotyka się z Uzumakim i przekazuje mu część swojej mocy, na wypadek ataku Sasuke na Konohę.

Sasuke odnajduje swojego brata i rozpoczyna się walka, podczas której Itachi wyjawia prawdę na temat trzeciego posiadacza Mangekyō Sharingan, Madary Uchihy, który był zarówno jego mentorem, jak i wspólnikiem podczas rzezi klanu Uchiha. Sasuke prezentuje jedną ze swoich technik: Kirin, która wywołuje ogromną burzę. Kieruje w stronę starszego brata ogromne wyładowanie elektryczne, które zwala go z nóg. Itachi jednak przeżył ten atak, ponieważ użył ostatniej z trzech technik Mangekyō Sharingan, Susanoo. Sasuke próbuje atakować eterycznego wojownika różnymi jutsu, które są bez wyjątku blokowane przez szkielet. Chwilę później Itachi zaczyna, najprawdopodobniej z powodu wyczerpania walką, kaszleć krwią. Podchodzi chwiejnym krokiem do młodszego brata pukając go w czoło, podobnie jak to robił w przeszłości, po czym osuwa się martwy na ziemię. Jak później się okazuje, Itachi tuż przed swoją śmiercią przekazał bratu wszystkie swoje techniki związane z Mangekyou Sharingan, by go chronić.